信号微弱或没有信号
可能原因
建议
样品保存不当；如果荧光团暴露于光线下的时间过长，可能会导致信号衰减。
在避光条件下进行孵育和保存样本。可在防淬灭溶液中封固样品，比如 ProLong® Gold Antifade Reagent #9071。为了获取最佳结果，样本封固后要立即采集图像。
细胞/组织样品保存期过长
使用新制备的载玻片/平板，以避免丧失抗原。
固定不充分
请查阅 CST 产品说明书中建议的操作步骤；处理后立即移除介质并在固定剂中快速/彻底清洗。对于磷酸化特异性的抗体，使用浓度至少 4% 的甲醛来抑制内源性磷酸酶。
不正确抗体稀释比例（抗体过度稀释）
请查阅 CST 产品说明书或访问 cellsignal.com 了解建议的抗体稀释度。
未使用建议的孵育时长
根据经严格检测的操作步骤进行一抗孵育，才能获得一致、可靠的结果。经开发和验证的 CST 抗体在 4°C 下过夜孵育时可获得最佳结果。
不恰当的检测系统
在可能得情况下，应通过蛋白印迹法或其它方式来确认蛋白表达。
未正确地诱导靶标蛋白
应针对每种靶标确定各自的最佳处理条件和对照。
目标蛋白表达量较低
修改检测方法；考虑放大信号，或与更亮的荧光团配对。
错误的通透化方法
请查阅产品说明书中建议的操作步骤。
二抗使用不当
按建议的浓度使用并检查二抗是否与一抗的宿主物种相匹配。
错误的激发波长
确保激发和检测（激光/激发/发射滤光器）与荧光基团激发光波长相匹配。
多重 IHC 中信号弱
优化脱蜡、抗原修复和信号放大方法。
高背景
可能原因
建议
样品自发荧光
以未染色的样本作为对照，检测自发荧光程度。请查看说明书中适用的固定试剂。用久了的固定剂可能会出现自发荧光；更换陈旧甲醛母液并制备新鲜的稀释液。使用在安瓿中新稀释，可用于EM 级电子显微镜的戊二醛。为低丰度靶标选择波长较长的波长通道。
封闭不充分
使用与二抗相同物种的正常血清。根据本底来源，考虑使用基于电荷的封闭剂，比如 Image-iT® FX Signal Enhancer #11932。
不正确的抗体稀释度（一抗或二抗浓度过高）
请查阅 CST 产品说明书或访问 cellsignal.com 了解建议的抗体稀释度。
样本变干
在整个染色过程中，确保样本始终浸没在液体中至关重要。
清洗不充分
清洗以去除多余固定剂、多余二抗，以及结合松散的非特异性的抗体相互作用。
二抗交叉反应
使用同型对照抗体确定您的二抗是否发生交叉反应。
非特异性抗体结合
有可能的话，请与敲低（siRNA) 或敲除细胞比较，或与已知靶抗原表达水平较高或较低的细胞进行比较。